martes, 27 de julio de 2010

Centrifugación


La centrifugación es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente densidad mediante una fuerza rotativa , la cual imprime a la mezcla con una fuerza mayor que la de la gravedad, provocando la sedimentación de los sólidos o de las partículas de mayor densidad. Este es uno de los principios en los que la densidad: Todas lículas, por posa, sectadas por cualquier y una extensa variedad de técnicas derivadas de esta. Donde la fuerza es mayor a la gravedad.

Fundamento teórico

El objetivo de la centrifugación es separar sólidos insolubles(de particulas muy pequeñas dificiles de sedimentar)de un liquido. Para ello, se aplica un fuerte campo centrífugo, con lo cual las partículas tenderán a desplazarse a través del medio en el que se encuentren con la aceleración G. E=velocidad angular2 x radio de giro.

Tipos de centrífugas

Los aparatos en los que se lleva a cabo la centrifugación son las centrífugas. Una centrífuga tiene dos componentes esenciales: rotor (donde se coloca la muestra a centrifugar) y motor. Existen dos tipos de rotores:

  • De ángulo fijo: Los tubos se alojan con un ángulo fijo respecto al eje de giro. Se usa para volúmenes grandes.
  • Basculante: Los tubos se hallan dentro de unas carcasas que cuelgan. Estas carcasas están unidas al rotor con un eje y cuando la centrífuga gira, se mueven. Se usan para volúmenes pequeños y para separar partículas con un mismo o casi igual coeficiente de sedimentación.

Las centrífugas están metidas en el interior de una cámara acorazada a unos 4ºC. Si esta cámara no estuviese presente, al comenzar la centrifugación, y debido al rozamiento con el aire, subiría la temperatura de la muestra y podría llegar a desnaturalizarse.

Una centrífuga debe tener las masas de las muestras compensadas unas con otras. En caso contrario, la centrífuga podría "saltar por los aires". Aunque hoy en día, para que esto no ocurra, casi todas las centrífugas se detienen si las masas no están compensadas.

Existen dos grandes grupos de centrífugas:

Analíticas: Con las que se obtienen datos moleculares (masa molecular, coeficiente de sedimentación, etc.). Son muy caras y escasas.

Preparativas: Con las que se aíslan y purifican las muestras. Hay 4 tipos de centrífugas preparativas:

  • De mesa: Alcanzan unas 5.000 rpm (revoluciones por minuto). Se produce una sedimentación rápida. Hay un subtipo que son las microfugas que llegan a 12.000-15.000 rpm. Se obtiene el precipitado en muy poco tiempo.
  • De alta capacidad: Se utilizan para centrifugar volúmenes de 4 a 6 litros. Alcanzan hasta 6.000 rpm. Son del tamaño de una lavadora y están refrigeradas.
  • De alta velocidad: Tienen el mismo tamaño que las de alta capacidad y llegan a 25.000 rpm.
  • Ultracentrífugas: Pueden alcanzar hasta 100.000 rpm. También están refrigeradas. Son capaces de obtener virus.

Tipos de centrifugación

  • Centrifugación diferencial: diferencia en la densidad de las moléculas. Esta diferencia debe ser grande pervada al centrifugar: Las partículas que posean densidades similares sedimentaraíficoiza como centrifugación preparativa para separar ponentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de núcleos y membrana)útil para separar moléculas.
  • Centrifugación isopícnica: Partículas con el mismo coeficiente de sedimentación se separan al usar medios de diferente densidad. Se usa para la separación de ADN con mucha frecuencia.
  • Centrifugación zonal: Se separan partículas con distinto coeficiente de sedimentación por la acción de determinados tampones.
  • Ultracentrifugación...: Permite estudiar las características de sedimentación de estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y biomoléculas. Utiliza rotores (fijos o de columpio) y sistemas de monitoreo. Existen diferentes maneras de monitorear la sede las partículas en la ultracentrifugación, el más común de ellos mediante luz Uerfresones

Espectrofotometría


Espectrofotometro.

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.



Principio de la Espectrofotometría

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

La espectrofotometría ultravioleta-visible usa haces de radiación del espectro electromagnético, en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm y en el de la luz visible de 400 a 800 nm , por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro.

Al campo de luz uv de 200 a 400 nm se le conoce también como rango de uv cercano , la espectrofotometría visible solamente usa el rango del campo electromagnético de la luz visible , de 400 a 800 nm.

Además, no está de menos mencionar el hecho de que la absorción y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentración y de la distancia recorrida.

Ley de Beer

La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución.

Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azúcar diluida y en otro tenemos un vaso con la misma cantidad de agua pero con más azúcar diluida. El vaso es una celda fotoeléctrica, y la solución de azúcar es la que se mide su concentración.

Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos.

Ley de Lambert

En la Ley de Lambert se dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz.

Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pero ahora, pensemos que ambos tiene la misma cantidad de agua y la misma concentración de azúcar, pero, el segundo tiene un diámetro mayor que el otro.


Según la ley de Lambert, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos; de la misma forma que se explicó en la ley de Beer.

Ley de Bouguer-Beer-Lambert

Una ley muy importante es la ley de Bouguer-Beer-Lambert (también conocida como ley Lambert Bouguer y Beer) la cual es solo una combinación de las citadas anteriormente.

Transmitancia y absorción de las radiaciones

Al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones, por las leyes mencionadas anteriormente, hay una pérdida que se expresa con la ecuación:

It/Io=T-kdc''

Donde It , es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoeléctrica (llamada radiación o intensidad transmitida); y Io que es la que intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiación intensidad incidente) y la relación entre ambas (T) es la transmitancia.

En el exponente, el signo negativo se debe a que la energía radiente decrece a medida que el recorrido aumenta. Donde k es la capacidad de la muestra para la captación del haz del campo electromagnético, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometría que recorre la radiación, y c es la concentración del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta.

La ecuación simplificada de la ley de Beer-Lambert

A = ε.d.c

Comprende a la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbancia de la muestra (A), el espesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de calibración relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares.

La absorción (o absorbancia) es igual a A, la es el logaritmo del reciproco de la transmitancia:[1]

A= log 1/T

lo que es igual a:

A= -log T

Las ecuaciones mencionados de las leyes son validas solo y solo sì:[1]

  • La radiación incidente es monocromática.
  • Las especies actúan independientemente unas de otras durante la absorción.
  • La absorción ocurre en un volumen de sección trasversal uniforme

Aplicaciones

Las aplicaciones principales son:

  • Determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto utilizando las fórmulas ya mencionadas.
  • Para la determinación de estructuras moleculares.
  • La identificación de unidades estructurales especificas ya que estas tienen distintos tipos de absorbancia (grupos funcionales o isomerías)

algunas cromatografias

Cromatografía en capa fina.

Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la acción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes más utilizados son gel de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia : f254 ó f366.

La placa seca se coloca en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil líquida).El eluente ascenderá o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” que representan a los componentes, la separación se da por migración diferencial, es decir que la fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación. Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de métodos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible.
El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.




Cromatografía en papel.
El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatográfico en el tanque cromatográfico.

Cromatografía en Columna.

se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna.
La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separación, y por tanto la resolución, aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales, disminuyendo por tanto la resolución.

. Cromatografía de gases.

Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatógrama.

La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separación. La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la detección y cuantificación de las sustancias, midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del papel.


Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).
Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la resolución.
El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.
En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.

Cromatografía de intercambio iónico.

La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.

. Cromatografía por Permeabilidad en Gel.
Es útil para la separación de proteínas. La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel, separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta.

Cromatografía de Afinidad.
La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.


Tipos de cromatografía

Naturaleza de fase estacionaria

Naturaleza de fase estacionaria
Sólido
Adsorción
Exclusión
Cambio iónico
Afinidad
Líquido
Partición
Naturaleza de fase móvil
Liquido
Líquido-líquido ((partición)
Líquido-sólido)adsorción, cambio iónico, exclusión, Afinidad.
Gas
Gas-líquido (CGL)
Gas-sólido (CGS)

Cromatografía de afinidad

Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos, lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular.


Fundamento de la cromatografía de afinidad








En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.
La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas

  • Alta selectividad en el mecanismo de retención
  • Campo de aplicación restringido
  • Separación de un solo soluto analito
  • Empleo de sistema de baja presión
  • Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica
  • Ligandos de afinidad

    Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente. Y según su actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad; se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.


    Esquema de un cromatograma de afinidad.

    Soportes
    El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, tamaño del grano controlable, porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión.
    El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.

    Inmovilización de ligandos

    La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas.
    El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción.
    El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.
    La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales:
    - Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo, fundamentalmente con el soporte activado.

    Metodos de elución

    Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave distinguir los procedimientos generales de elución como:
    Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular, produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no, con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida.
    La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación más frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito, por lo que es retirada del sólido y eluida. Ejemplo, la purificación de la lectina.
    La elución invertida, se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoproteína.
    En la elución no bioespecífica, la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan.

    NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIA

    TERMINO
    Cromatografía.

    La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.
    Cromatógrafo.

    El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.
    Cromatógrama.

    Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatógrama" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.
    Fase Ligada.

    Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la columna.
    Fase Inmovilizada.

    Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.
    Fase Móvil.

    Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido Supercrítico). En la cromatografía de gases se uede usar la expresión Gas Portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión Eluyente.
    Eluir.

    Aplicar la cromatografía de elución. El proceso de elución se puede detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas anteriores de cromatografía plana.
    Efluente.

    La fase móvil que abandona la columna.
    Muestra.

    Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.
    Componentes de la Muestra.

    Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos Eluito y Analito para un componente de la muestra

    Métodos principales

    Cromatografía Frontal:

    Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna fase móvil adicional
    Cromatografía de Desplazamiento:

    Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequeña cantidad en un intervalo breve.
    Cromatografía de Elusión:

    Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequeña cantidad en un tiempo breve.


    Cromatografía en Columna:

    Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo. Las partículas de fase estacionaria sólida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida, pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase móvil por el centro del tubo (Columna Tubular Abierta).
    Cromatografía plana:

    Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano. Éste puede ser un papel, que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel), o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina, TLC). A veces a la cromatografía plana se la llama también Cromatografía de Lecho Abierto.

    cromatografía en capa fina

    Introducción

    La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.

    La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.

    Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:

    hidrocarburos <>

    aldehído <>

    Ventajas de la cromatografía en capa fina

    La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos.

    Adsorbentes

    Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir un adherente (yeso,...). Algunos de los adsorventes más utilizados son:

    • Celulosa
    • Almidón
    • Azucares
    • Gel de sílice (silicagel)
    • Óxido de aluminio (alúmina)
    • Carbón activo (carbón en polvo)
    • Kieselguhr

    Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y animales.

    Silicagel

    El gel de sílice o ácido silícico es uno de los más utilizados, es débilmente ácido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deberá utilizar con sustancias que se corrompan con los ácidos. Los geles de sílice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor también se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. El tamaño del grano suele ser de 10 a 40 micras (µ) y el tamaño de poro varía de 20 a 150Å.

    Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de cálcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de sílice.

    Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides, ácidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina cromatografía de fase reversa (silanizado).

    Alúmina

    La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina, dándole a ésta un carácter básico. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de sílice.

    La alúmina puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas ácidas, básicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas. Es un adsorbente de carácter polar, de tal forma que retendrá con mayor avidez a los componentes polares.

    Preparación de placas.

    El adsorvente se deslíe en agua destilada. Para mezclar la papilla homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico. La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general, no obstante, habrán de consultarse la instrucciones del fabricante.

    Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, láminas de vidrio, pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros compuestos orgánicos más flexibles. Dependiendo del tipo de separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro. En general para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80 ml. de agua destilada.

    Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado. En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes.

    Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le denomina argentación, y se utiliza para separar componentes insaturados.

    El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en general suele ser de:

    0.1-0.2 mm. para separaciones analíticas.

    0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.

    La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectarían al desarrollo del proceso cromatográfico. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas homogéneas del espesor deseado. Si no se disponer de extensor, el proceso a seguir es el siguiente:

    1. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.
    2. Agitar enérgicamente.
    3. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.
    4. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
    5. Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.

    Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metálicas. En este momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien calentándolas durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura.


    Aplicación de las muestras

    Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación.. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 µg de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas.

    Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centímetro aproximadamente. El punto de aplicación de la muestra se denomina toque.

    Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar.

    Elección del eluyente

    La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo.

    Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

    Eter de petróleo.
    Eter dietílico.
    Ciclohexano.
    Acetato de etilo.
    Tetracloruro de carbono.*
    Piridina.
    Benceno.*
    Etanol.
    Cloroformo.*
    Metanol.
    Diclorometano.
    Agua.
    Ácido acético.

    *compuestos cancerígenos.

    En la elección del eluyente influyen varios factores:

    • Precio.
    • Pureza.
    • No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
    • No utilizar compuestos muy volátiles.
    • Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

    La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

    Elección del eluyente

    a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.

    b) Aplicando un eluyente poco polar.

    c) Aplicando un eluyente más polar.

    Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares, hasta dar con el más apropiado.

    Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera más eficaz.

    Desarrollo de la cromatografía

    El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la acción de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. Para conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara, las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes, cosa que no debe olvidarse.

    Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas.

    Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.; parece ser la más conveniente para medir valores de RF. Después del desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente.

    La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.

    Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz, se secará en una cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.

    Localización de sustancias

    Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:

    • Métodos químicos.
    • Métodos físicos.

    Métodos químicos

    Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido.

    Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverización deberá realizarse en una vitrina de gases bien ventilada.

    La pulverización se realizará poco a poco. En cromatografía en capa fina no puede realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en papel sí).

    Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas.

    Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras.

    El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado.

    Además de estos reveladores generales, existen otros específicos:

    • 2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).
    • Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos).
    • Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
    • Ninhidrina (para aminoácidos).

    Métodos físicos.

    El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.

    Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta.

    Constantes Rf Y Rx

    La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un componente. Se define como:

    Constantes Rf Y Rx

    La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha, los cálculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.

    Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo.

    Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separación mínima. En este caso no se pueden usar reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino indIcador ultravioleta.

    También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X), que tenga una posición de desarrollo conveniente; todos los demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste. De esta manera se tiene el , RX , ya que:

    CROMATOGRAFIAS

    La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y la física. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

    Las técnicas cromatográficas[1] son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto.

    Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

    La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

    • Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
    • Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.

    Clasificación

    Tipos Fase móvil Fase estacionaria
    Cromatografía en papel Líquido Líquido ( moléculas de agua contenidas en la celulosa del papel )
    Cromatografía en capa fina Líquido Sólido
    Cromatografía de gases Gas Sólido o líquido
    Cromatografía líquida
    en fase inversa
    Líquido (polar) Sólido o líquido
    (menos polar)
    Cromatografía líquida
    en fase normal
    Líquido
    (menos polar)
    Sólido o líquido
    (polar)
    Cromatografía líquida
    de intercambio iónico
    Líquido (polar) Sólido
    Cromatografía líquida
    de exclusión
    Líquido Sólido
    Cromatografía líquida
    de adsorción
    Líquido Sólido
    Cromatografía de
    fluidos supercríticos
    Líquido Sólido


    Las distintas técnicas cromatográficas[3] se pueden dividir según cómo esté dispuesta la fase estacionaria:

    La cromatografía de gases es útil para gases o para compuestos relativamente volátiles, lo que incluye a numerosos compuestos orgánicos. En el caso de compuestos no volátiles se recurre a procesos denominados de "derivatización", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilizen en las condiciones de análisis.

    Dentro de la cromatografía líquida destaca la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés High Performance Liquid Chromatography), que es la técnica cromatográfica más empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carácter no polar, y la fase móvil posee carácter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporción de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de sílice o alúmina, de carácter polar, y por tanto la fase móvil era un disolvente orgánico poco polar.

    Una serie eluotrópica, es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actúan como fase móvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria.

    Historia

    El botánico ruso Mijaíl Tswett[4] (Mikhail Semenovich Tswett, 1872-1919) empleó por primera vez en 1906 el término "cromatografía" (que proviene del griego χρομα y γραφω que significan respectivamente chroma "color" y graphos "escribir").

    separación de clorofilas mediante cromatografía en papel

    A comienzos del año 1903, Mijail Tsvet usó columnas de adsorción de líquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacían pasar a través de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido de un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que éstos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de la columna.

    Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) comenzó a desarrollarse en los años 1960, aumentando su importancia en las décadas siguientes, hasta convertirse en la técnica cromatográfica más empleada. Sin embargo esto se irá modificando con el paso de los años.

    Términos empleados en cromatografía

    • Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografía.
    • Cromatografía analítica se emplea para determinar la existencia y posiblemente también la concentración de un analito en una muestra.
    • Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículas de soporte o a las paredes internas de la columa.
    • Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada.
    Cromatograma con picos no resueltos (separados) Cromatograma con dos picos resueltos
    En el eje X se representa el tiempo de retención, y en el eje Y una señal (obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema óptimo, la señal es proporcional a la concentración del analito específico separado.
    • Cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada. Por ejemplo, un cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos.
    • Cromatografía es el método físico de separación en el cual los componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida.
    • Efluente es la fase móvil que atraviesa la columna.
    • Serie eluotrópica es una lista de disolventes clasificados según su poder de dilución.
    • Fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre partículas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.
    Cromatograma correspondiente a una cromatografía liquida en fase reversa para compuestos fenólicos
    • Fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases) o un fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La fase móvil consiste en la muestra que está siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el interior de la columna. En el caso de la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, la fase móvil es un disolvente no-polar como el hexano (fase normal) o bien algún disolvente polar (cromatografía de fase reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase móvil se mueve a través de la columna de cromatografía (fase estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase estacionaria y se separa.
    • Cromatografía preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para un uso posterior, más que para análisis.
    • Tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito particular en pasar a través del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas. Véase también: Índice de retención de Kovats
    • Muestra es la materia que va a as er analizada en la cromatografía. Puede consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso del análisis, la fase o fases que contienen los analitos de interés es llamada igualmente muestraresiduo. mientras el resto de sustancias cuya separación no resulta de interés es llamada
    • Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
    • Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la fase líquidamóvil en cromatografía de líquidos.
    • Fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición en el procedimiento de la cromatografía. Un ejemplo es la capa de silica en la cromatografía en capa fina.


    TIPOS DE ACIDOS NUCLEICOS,ADN, ARN Y MAS

    Los ácidos nucleicos son principios inmediatos orgánicos constituidos por carbono, oxígeno, hidrógeno, nitrógeno y fósforo.

    Los ácidos nucleicos están constituidos por cinco tipos de moléculas denominadas nucleótidos. Éstos son la adenina (A), la citosina (C), la guanina (G), el uracilo (U) y la timina (T).

    Existen dos tipos de ácidos nucleicos: el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). El ADN tiene como misión dirigir las funciones vitales de la célula, la nutrición, reproducción y relación, mediante la información que contiene. Los diferentes tipos de ARN tienen como misión cooperar con el ADN.

    Las células pueden ser eucarióticas si el ADN está en el interior del núcleo celular, y procarióticas si el ADN se encuentra libre en el citoplasma celular.

    1)

    Los ácidos nucleicos están formados por un azúcar (pentosa), bases nitrogenadas (purinas o pirimidinas) y ácido fosfórico.

    La hidrólisis completa de ADN ( o ARN) da:

    • Pentosa -desoxirribosa (ribosa).

    • Bases Nitrogenadas: Purinas : Adenina y Guanina.

    Pirimidinas: Citosina y Timina (Uracilo)

    • Ácido Fosfórico H3PO4


    Ácidos nucleicos

    Una molécula de ácido nucleico es un polímero lineal en el cual los monómeros (nucleótidos) están unidos por medio de puentes o uniones fosfodiéster. Estos puentes unen el carbono 3´ en la pentosa de un nucleótido al carbono 5´ en la pentosa del nucleótido adyacente.

    En consecuencia, el eje de ácido nucleico está formado por fosfatos y pentosas alternados. Las bases nitrogenadas están unidas a los azúcares de este eje.

    El ácido fosfórico utiliza dos de sus tres grupos ácidos en las uniones 3´, 5´- diéster. El grupo restante confiere al poli nucleótido sus propiedades ácidas y permite que la molécula forme uniones iónicas con proteínas básicas. Éste grupo ácido libre hace también que los ácidos nucleicos sean intensamente basófilos, es decir, que se colorean fácilmente con colorantes básicos.

    Una hidrólisis moderada fragmenta el ácido nucleico en los nucleótidos que se forman por la unión covalente de un fosfato y una base heterocíclica a la pentosa.

    Las pentosas son de dos tipos: Ribosa en el ARN, y desoxirribosa en el ADN. La única diferencia entre estos dos azúcares es que la desoxirribosa tiene un átomo menos de oxígeno.

    Las bases nitrogenadas que se encuentran en los ácidos nucleicos son anillos heterocíclicos compuestos además de carbono e hidrógeno por nitrógeno. Son de dos tipos fundamentales: las bases Purinas (por ser derivadas de la purina, de dos anillos heterocíclicos) y las bases Pirimidinas (por ser derivadas de la pirimidina de un solo anillo).

    Dichas bases son cinco, pero en realidad solamente cuatro aparecen en el ADN. Las bases purinas presentes son: la adenina y guanina. Y las bases pirimidinas son: la citosina y la timina (el uracilo es característico del ARN).

    Sin embargo, es útil recordar que existen dos diferencias fundamentales entre el ADN y ARN: el ADN tiene una desoxirribosa y el ARN una ribosa. También el ADN contiene timina y el ARN uracilo. La diferencia de las bases pirimidicas hizo posible que los investigadores en biología celular usaran timidina radiactiva como marcador específico del ADN, y uridina radiactiva para el ARN.

    Dichas bases se hallan unidas a un monosacárido simple, la desoxirribosa (una pentosa que se diferencia de la ribosa por la ausencia de un grupo oxidrilo). Se une a la base por medio de su carbono 1 (el primero del ciclo), correlacionándose con una de las moléculas de Nitrógeno de la base. La unión del azúcar y la base forma lo que denominamos nucleósido (Ej: Desoxiadenosína,).

    A la pentosa y por medio de su carbono 5 (el último del ciclo) se une un grupo fosfato, por enlace covalente constituyendo el nucleótido, junto al azúcar y la base.

    Si bien para la constitución del ADN se unifica a un solo grupo fosfato, existen en las células una serie de nucleótidos de singular importancia en el metabolismo celular. Estos producen enlaces muy ricos de energía y los di- y tri- nucleótidos como el adenosin-tri-fosfato (ATP) son los encargados de muchos procesos metabólicos.

    POLINUCLEÓTIDO
    Ácidos nucleicos

    2) Existen dos tipos de ácidos nucleicos: el ARN y el ADN

    Ácido desoxirribonucleico o ADN: fue descubierto por el químico suizo Friedrick Miescher en 1868. Sin embargo, esta macromolécula no logró identificarse químicamente hasta muchos años más tarde, en la década del 50. Hoy sabemos que el ADN está formado por la unión de muchos desoxirribonucleótidos, cuya secuencia actúa como un alfabeto molecular almacenando toda la información genética del individuo.

    En las células procariontes hay una sola molécula de ADN, que suele adoptar la forma de un circulo cerrado. En las células eucariontes, en cambio, hay varias moléculas diferentes, con una longitud mucho mayor que la del ADN procariótico. Por esta razón, el ADN eucariótico se organiza de una manera más compleja, para que pueda ser contenido en el interior del núcleo celular.

    Durante mucho tiempo se hicieron investigaciones para entender cómo estaba estructurado el esqueleto de la molécula de ADN: aunque se conocía la composición química de sus unidades básicas, no se comprendía cómo se organizaban en esta importante macromolécula. Estudios bioquímicos mostraron que los nucleótidos se unían a través de un enlace llamado fosfodiester. En este enlace participa un grupo OH (hidroxilo) del carbono número tres de la desoxirribosa, con el hidroxilo del carbono cinco de la desoxirribosa del nucleótido siguiente, actuando el fosfato como puente entre ellas.

    Sin embargo, solo en 1953 se logró conocer el modelo del ADN. Ese año, James Watson y Francis Crick, dedujeron la estructura tridimensional de la molécula de ADN conocida como ADN-B.

    La investigación con respecto a la estructura del ADN continuó, gracias al trabajo de numerosos investigadores, entre los que destaca Richard Dickerson, quien demostró que el ADN es una molécula dinámica, que puede adoptar diversas formas. Así, se reconoció la existencia de otras dos ordenaciones tridimensionales, conocidas como ADN-A y ADN-Z las cuales tienen algunas diferencias con el ADN-B son más anchas y al forma Z más angosta que la B. Finalmente el ADN-Z se enrolla hacia la izquierda, mientras que las formas A y B lo hacen hacia la derecha.

    El ADN es por lo común el constituyente básico de la cromatina (cromosoma) nuclear en las células eucariónticas, pero también existe en pequeña cantidad en las mitocondrias y cloroplastos. En los procariontes forma el nucloide (que a diferencia de los eucariontes no va asociado a proteínas, es desnudo) y en los virus (DNA virus) que lo poseen constituyen el virión o elemento infestante.

    Por lo común su estructura tridimensional posee giro hacia la derecha (ß-ADN,dextrogiro) que es la forma más estable y ocasionalmente posee giro ha la izquierda (z-ADN,levógiro)

    Acorde a las evidencias, sólo una pequeña parte del ADN constituye genes (menos del 10 %). Existen diferentes tipos que los podemos dividir en:

    -ADN de copia única (el 57 % del total) formados por segmentos de aproximadamente 1000 pares de nucleótidos longitud, una pequeña parte de este ADN contiene los genes.

    -ADN repetitivo (20 %) son unidades de aproximadamente 300 pares de nucleótidos que se repiten en el genoma unas 105 veces(Unidades de repetición). Se intercalan con el ADN de copia única.

    -ADN satélite (altamente repetitivo: 28 %)son unidades cortas de pares de nucleótidos que se repiten en el genomio. Son característicos en cada especie y pueden ser separados por centrifugación. Constituyen la heterocromatina y no se le conoce función.

    Los porcentajes indicados son del hombre y el ratón, y las proporciones serían las mismas en otras especies.

    Ácido ribonucleico o ARN: esta macromolécula representa alrededor del 7% del peso de una célula. Esta constituida por largas cadenas de ribonucleotidos, unidos por enlaces fosfodiester.

    El ADN y el ARN tienen diferencias. Por ejemplo, la pentosa del ARN es la ribosa; en el ADN es la desoxirribosa. Este hecho determina que el ADN sea resistente al tratamiento con bases fuertes (álcalis), a diferencia del ARN que se degrada por la acción de estas sustancias. Otra diferencia es que el ARN es una monohebra y no una cadena doble, como ocurre en el ADN. Finalmente, el ADN incluye las bases nitrogenada A,G,C y T; en el ARN, en cambio, la timina es remplazada por el uracilo.

    Hay al menos tres tipos de ARN:

  • ARN mensajero: ácido nucleico que contiene la información para dirigir la síntesis de una o más proteínas específicas. La información se encuentra contenida en grupos de tres nucleótidos llamados codones, los cuales determinan el aminoácido que debe incorporarse en la proteína que se va a sintetizar. El nombre mensajero deriva de su papel el intermediario: actúa como vehículo de transporte de información genética entre el ADN y las proteínas.

  • ARN de transferencia: son moléculas relativamente pequeñas que intervienen en la síntesis de proteínas, complementando la función del ARN mensajero. Contienen entre 75 y 90 nucleóditos dispuestos en forma de trébol. Cada ARN tiene una secuencia de tres nucleóditos llamada anticodón. La cual resulta clave para la síntesis de proteínas.

  • ARN ribosomal: es el ARN más abundante en las células; desempeña una función estructural como componente de un importante complejo supramolecular llamado ribosoma. Los ribosomas, formados por proteínas y ARN ribosomal y participan activamente en la lectura de la molécula de ARN mensajero para sintetizar las proteínas contenidas en la secuencia de codones del ARN mensajero.

  • 3)

    La similitud más señalada entre ácidos nucleicos procariontes y eucariontes, es que comparten sólo las estructuras: primarias y secundarias. Y discrepan totalmente en su estructura terciaria, la cual es la forma en que se almacena el ADN en un volumen reducido.

    En el caso de las bacterias (células procariontes), contienen sólo una molécula bicatenaria (doble hélice) circular cerrada, no asociada a proteínas, por tanto se le denomina ADN desnudo. A pesar de no poseer proteínas asociadas, sólo tienen proteínas que controlan la transcripción y replicación. Para empaquetarse se pliegan como una superhélice, que consiste en plegamiento de la doble hélice, algo así como un trenzamiento.

    Este cromosoma no se encuentra separado por ninguna membrana, así que no presenta un núcleo verdadero u organizado, sino sólo una zona nuclear o nucleoide, dispersa en el citoplasma. El cromosoma procarionte generalmente está conectado al mesosoma.

    No obstante, muchas bacterias poseen también, pequeñas moléculas de ADN circulares llamados plásmidos, que llevan información genética, pero, la mayoría de las veces, no resultan esenciales en la reproducción.

    Por su parte en las células eucariontes, las moléculas de ADN se encuentran asociadas a proteínas, las cuales están organizadas en cromosomas que suelen aparecer dispuestos en pares idénticos. Estos tipos de proteínas pueden ser de dos tipos: histonas y proteínas cromosómicas (no histónicas).

    El material genético de ésta célula a diferencia de la procariótica se encuentra delimitado por un núcleo.

    En conclusión, los ácidos nucleicos son la base química de la herencia en cualquier tipo de célula, encontrándose al interior de cada cromosoma, siendo una molécula única, muy larga y enrrollada que contiene secuencias lineales de genes. Éstos encierran a su vez instrucciones codificadas para la construcción de las moléculas de proteínas y ARN necesarias para producir una copia funcional de la célula.

    4)

    Hasta Dónde Hemos Llegado


    Según la perspectiva histórica, el Lupus de la piel, Lupus Discoide fue denominado en 184O. A fines del siglo XIX se describió el Lupus Sistémico en aquellos pacientes que tenían complicaciones en otros órganos diferentes de la piel.

    La célula LE, primera evidencia de la presencia de autoanticuerpos en el Lupus fue hecha en 1948, y la primera observación de anticuerpos contra el DNA ocurrió en 1957. Sólo en 1965 los investigadores descubrieron la presencia de inmunocomplejos formados por DNA y anti DNA, que fue tan importante en nuestro conocimiento de los mecanismos de daño tisular en el Lupus.

    Hoy en día se entiende la importancia de las células T y las células B en el sistema inmunológico. Estas células fueron identificadas por primera vez como subclases de linfocitos o células blancas en 1969. El descubrimiento de las células reguladoras supresoras y de ayuda en el sistema inmunológico, así como el conocimiento de que estas células funcionan mediante la secreción de ciertos factores solubles, ha sido adquirido más recientemente, en la década del setenta. Al mismo tiempo los investigadores comenzaron a considerar que los pacientes con Lupus tienen un problema en la regulación inmunológica, hecho verificado muy recientemente.

    En resumen, la historia documentada de la biología tiene más de cuatro mil años. Lo que se sabe del Lupus se ha aprendido en los últimos cuarenta años y la mayor parte de ello, en los últimos quince años.

    En nuestros días, un nuevo campo llamado psiconeuroinmunología parece estar abriéndose rápidamente. Los científicos en el campo de la medicina están examinando las interacciones del sistema inmulógico, del aparato endocrino y el sistema nervioso.

    Sus estudios nos dan a conocer conceptos tales como la importancia de la disposición de ánimo del paciente en varias enfermedades. Se sabe hoy en día que existen conexiones nerviosas directas entre el cerebro, el timo y el bazo. Estudios recientes en individuos afligidos indican que la tensión de la pena afecta la reacción del sistema inmunológico. Y en experimentos con animales, lesiones en ciertas partes del cerebro también tienen un efecto notable en dicho sistema.

    También se ha descubierto que por lo menos algunos linfocitos tienen receptores para un número de substancias químicas, que tanto el cerebro como el sistema endocrino usan como medios de comunicación, tales como estrógenos, adrenalina y endorfinas. Investigadores han demostrado que la predisposición psicológica, en experimentos con animales, provoca ya sea omisión o aumento en las reacciones inmunológicas, de acuerdo con las circunstancias.

    Estos avances mantienen la promesa de que rápidamente nos estamos acercando al entendimiento de cómo los factores psicológicos y las hormonas influyen en las enfermedades como el Lupus.

    PRÁCTICA VIA: SERVIDORES Y PROGRAMAS PARA ANÁLISIS DE DNA-CHIPS

    Ya te han hablado de las enormes posibilidades que ofrece la tecnología de los DNA-chips y DNA-microarrays (DNA-arrays, en general) pero... si tuvieses que montar todo lo necesario para realizarlos en un laboratorio, ¿por donde empezarías? ¿Cómo podrías saber que hardware y que software se encuentra disponible? La respuesta mas inmediata a estas cuestiones se encuentra en Internet; dado que esta técnica ha surgido en pleno auge de La Red, la gran mayoría de los centros que llevan a cabo experimentos de este tipo hacen públicos sus resultados a través de ella.

    Aunque el número de estudios basados en DNA-arrays empieza a ser considerable, los centros de investigación capaces de realizarlos son todavía poco numerosos. Esto es debido a que hoy en día, es muy caro contar con todo el equipamiento necesario para llevar a cabo este tipo de experimentos y a que escasea el personal especializado. Ante este panorama, unas pocas empresas comercializan DNA-arrays ya fabricados o bien, los elaboran a medida para laboratorios con requerimientos muy concretos. Así, es posible comprar chips o membranas tapizadas de genes humanos de distintos tejidos, e incluso con el genoma completo de Saccharomices cerevisiae, listas para ser hibridadas.

    EMBRIOLOGÍA

    Seguramente, si al pasear con el coche por el campo se cruzase con un grupo de ovejas clónicas -o sea, exactamente iguales genéticamente- pastando en una montaña no se daría ni cuenta. Otra cosa muy distinta sería, por ejemplo, entrar a un vagón de metro y encontrarse consigo mismo, con su alter ego, una persona exactamente igual que usted. Una y otras situaciones son posibles, en teoría, desde el momento en el que el equipo de científicos del Instituto Roslin de Edimburgo presentó oficialmente el pasado sábado en sociedad a la primera oveja clónica obtenida por trasplante nuclear desde un animal adulto de seis años de edad. Todo el mundo la conoce ya. La foto de la oveja Dolly ha dado la vuelta al mundo y ha estado apareciendo en todos los rotativos desde hace días. Dolly nació el pasado mes de julio, pero sus creadores, los que la fabricaron en el laboratorio, han sabido mantenerla en secreto hasta el sábado pasado, justo el tiempo necesario para patentar el revolucionario descubrimiento. El animal es, o parece ser, absolutamente normal en todo salvo en la forma en la que fue concebido. Esta es la primera vez que se logra clonar un animal adulto, lo cual va a suponer sin duda una revolución en la biomedicina. El éxito de este experimento científico tiene una dimensión tal y ha sido tan inesperado, incluso para la comunidad científica, que algunos expertos empiezan a pensar que en un futuro no muy lejano quizá se debería cambiar el nombre que designa a un grupo de ovejas (rebaño) por el de clon. El éxito del equipo británico, liderado por el doctor Ian Wilmut significa un paso de gigante para la Ciencia. Y hay quien cree que cuando se escriban los libros de historia en el futuro, se hablará de la segunda mitad del siglo XX como la etapa en la que se logró la clonación de animales, del mismo modo que ahora se conoce a la mitad del siglo XIX por la Revolución Industrial.

    El logro de los científicos con la oveja Dolly que se publica hoy en Nature nada tiene que ver con los intentos de clonar animales realizados hasta ahora: el equipo de Wilmut ha reemplazado el material genético del óvulo de una oveja por el DNA de otro animal adulto y, de esta manera, se ha logrado crear una oveja -Dolly- que es un clon de un adulto. Los experimentos anteriores para clonar animales adultos se habían limitado a dividir los embriones en un estadio inicial, poco después de que el óvulo es fecundado por el espermatozoide. Por eso se cree que Wilmut es el primero que ha creado un clon utilizando el DNA de un adulto. Y es que, hasta ahora, los científicos creían que una vez que las células se habían diferenciado hasta convertirse en células de un ojo, o de la piel o, en el caso del experimento de Wilmut, del tejido mamario- su DNA ya no serviría para formar otro organismo desde cero. Ahora, mirando hacia atrás con perspectiva, parece que la técnica de Wilkin es sencilla, pero a nadie se le había ocurrido. Sin embargo, para entender el proceso, su importancia y las diferencias con las técnicas anteriores, bien merece la pena repasar los pasos que han recorrido los investigadores a lo largo de la historia en su intento de clonar animales.

    La historia de la clonación

    La palabra clon ha ido adquiriendo nuevos usos con el tiempo. Al principio se utilizaba para designar una población de células u organismos obtenida por reproducción vegetativa (asexual) de una sola célula u organismo, de modo que todos los miembros de un clon tienen la misma constitución genética. Más tarde, cuando la ingeniería genética permitió multiplicar un gen o un fragmento de DNA en las bacterias, se extendió el término a la clonación de genes. Pero, con los animales superiores, la idea de la clonación se hacía difícil ya que no se pueden reproducir asexualmente. Así, para clonarlos hay que eliminar quirúrgicamente el núcleo de una célula fecundada (cigoto) y sustituirla por el núcleo entero de otro animal. Los primeros experimentos de este tipo se hicieron con anfibios. Se eligieron los óvulos de rana porque esta célula es grande, sencilla de obtener y bastante fácil de manipular. Finalmente, estos estudios obtuvieron un éxito relativo y se lograron crear ranas clónicas, exactas unas a las otras, con la misma dotación genética. Para ello se cogieron unos óvulos de rana y se les quitó el núcleo. Y, por otro lado, se extrajo el núcleo de células embrionarias todavía totipotentes (es decir, que estaban en un estadio del desarrollo inicial desde el que podían derivar a cualquier tipo de célula).

    El núcleo de las células embrionarias se introdujo en los óvulos enucleados (sin núcleo). O, dicho de otra forma, se trasplantó el núcleo de las células de una rana al óvulo sin núcleo de otra rana, y, como resultado, se desarrollaron ranas adultas. Sin embargo, cuando se intentó el mismo experimento con núcleos extraídos de fases más evolucionadas -renacuajos o ranas adultas- el experimento falló y los embriones resultantes no llegaron a vivir mucho tiempo. Este estudio sirvió para descubrir que algo debía ocurrir con los núcleos de las células donantes más desarrolladas que los hacía incompatibles con el citoplasma en el que eran implantados. El nuevo núcleo era incapaz de sustituir al de la célula embrionaria. Ese algo -la función del núcleo que lleva el material genético con las órdenes pertinentes para estructurar el desarrollo de un ser vivo, (para hacer, por ejemplo, que la cabeza crezca en una parte y sólo ahí)- ha sido un gran misterio para la ciencia desde que el doctor Spemann se lo planteó por primera vez, hace 60 años: ¿Son los núcleos celulares equivalentes? ¿Es el genoma continuo durante el desarrollo? O, dicho de otra forma, ¿es viable un animal si se cambia un núcleo de un animal por el núcleo del óvulo de otro? ¿Se pueden clonar seres adultos? En 1952 se logró el primer éxito al clonar las ranas, pero quedaba pendiente la duda de si sería posible dar el mismo paso con animales superiores, con mamíferos, y, sobre todo, si sería posible implantar el núcleo de un animal adulto en un óvulo enucleado.

    Así que, los científicos se pusieron manos a la obra y lo intentaron con ratones. Corrían los años 80. Pero el fracaso fue rotundo. Se siguió exactamente el mismo protocolo, pero los ratones se desarrollaban con múltiples malformaciones y no pasaban de embriones. Sin embargo, después de esos intentos fallidos, otros experimentos con otro tipo de mamíferos -vacas y ovejas- han resultado más esperanzadores. Esa es precisamente la tarea que ha ocupado la vida de los investigadores escoceses del Instituto de Edimburgo, creadores de Dolly, desde hace décadas. El primer mamífero que se logró clonar fue una oveja. Los núcleos donantes, en este caso, provenían de un estado inicial del desarrollo del embrión (cuando la mórula, que así se llama a esta fase, tenía sólo unas 8-16 células). También fue Wilmut y su equipo del Instituto de Edimburgo el que logró clonar la primera oveja. El artículo salió en Nature el año pasado. Pero, Wilmut y sus colaboradores han guardado un as en la manga desde el pasado julio: el estudio del Nature de hoy muestra por primera vez que se pueden obtener animales clónicos con el mismo procedimiento que hasta ahora pero a partir de núcleos de embriones más maduros. Y, lo más importante, es que una de las ovejas producidas por su experimento -la estrella, Dolly- procede de una línea celular que cogió su fuente de material genético a partir de las células de la glándula mamaria de una oveja de seis años de edad.

    ¿Pero qué es lo que ha hecho viable a Dolly, y qué es lo que falló en los anteriores intentos de trasplantar núcleos de células adultas? Parece que la clave del éxito está en la compatibilidad entre el núcleo implantado y el citoplasma del óvulo receptor. Wilmut pensó que si las células donantes estuviesen fuera del ciclo celular, es decir, en fase G0, o, para entendernos semi-dormidas, quizás, al implantar el núcleo en el óvulo receptor se sincronizaría el desarrollo y se formaría un embrión viable y sin defectos genéticos. Y así fue. Wilmut colocó a las células en un cultivo, y manipuló su DNA hasta dejarlo en la fase quiescente. Después, sacó el núcleo de un óvulo que había sido extraído de otra oveja e introdujo el material genético de la oveja adulta en el óvulo enucleado. Cuando el material de las dos células (citoplasma del óvulo y núcleo de la célula del tejido mamario) se fundió, empezó a crecer con normalidad y Wilmut implantó el embrión en desarrollo en una tercera oveja que hizo de madre de alquiler. Este tercer animal es el que trajo al mundo a Dolly el pasado mes de julio. Este experimento ha demostrado que el mayor problema en el trasplante de ovocitos era la incompatibilidad del ciclo celular, y que al no tener esto en cuenta hasta ahora se creaban anormalidades cromosómicas una vez que se iniciaba el desarrollo del embrión. Estos resultados tienen una importancia radical. No sólo resuelve las dudas sobre la continuidad del genoma sino que se va a revolucionar el mundo de la ingeniería genética, la manipulación de animales para convertirlos en fábricas de fármacos, o para estudiar, por ejemplo, el envejecimiento.

    5) REPLICACIÓN DEL ADN

    Años después de su elaboración, el modelo de Watson y Crick recibió un fuerte apoyo experimental de varias fuentes. Arthur Kornberg y sus colegas aislaron en 1957 la enzima de ADN polimerasa, de bacterias. Esto cataliza la síntesis de ADN y requiere como substratos los tritosfatos de los cuatro desoxirribonucleósidos(abreviadamente dATP, dGTP, dCTP, y dTTP). El sistema de reacciones requiere además iones de magnesio(Mg ++) y una pequeña cantidad de ADN de alto peso molecular para que sirva de cebo o plantilla para la reacción. El producto de la reacción es más polímero ADN y una molécula de desoxirribonucleótido incorporado.

    ADN

    dATP Mg+ +

    dGTP

    dCTP ADN + nPPi

    dTTP n ADN polimerasa

    El nucleósido tritosfato ataca al 3'- hidroxilo libre de la última desoxirribosa de la cadena y forma un enlace de éster, liberando una molécula de pirofosfato (figura1). Cuando se titularon los desoxirribonucleótidos tritosfatos con 14C, el polímero ADN producido contenía 14C, dando a entender que los nucleótidos titulados habían sido incorporados a la cadena ADN. Mediante apropiados experimentos con los nucleótidos rotulados 14C, Kornberg pudo demostrar que las razones de A: T y de G: C en el ADN sintetizado eran iguales a las correspondientes razones de ADN usado como cebo.

    Esto sugirió que el ADN producido es una copia de la plantilla ADN, predicha por el modelo de Watson y Crick.

    Diagrama del enlace de hidrogeno entre los pares básicos de adenina y timina (arriba)

    Y de guanina y citosina (abajo ) en el ADN. El par A-T tiene dos enlaces de hidrogeno y el par G-C tiene tres.

    La polimerasa del ADN, procedente de Escherichia coli usará plantilla de ADN, aislada de cualquiera de una gran variedad de fuentes(bacterias, virus, células de mamífero y células vegetales) y producirá ADN con una razón de nucleótidos comparable a la de la plantilla usada. Así, la serie de nucleótidos del producto la dicta el orden del cebo ADN, y no a las propiedades de la polimerasa, ni a la razón de las moléculas de substrato presentes en la mezcla reactiva. Usando una enzima más purificada, Kornberg pudo sintetizar biológicamente, en 1968, ADN viral activo, usando ADN viral como cebo. El ADN producido infectaría bacterias de igual modo que los virus "vivos".

    Khorana y sus colegas sintetizaron algunos polímeros de desoxirribonucleótidos que contienen ácidos adenílico y citidílico, y otros polímeros que contienen ácidos timidílico y guanílico alternativamente. Ninguno de estos polímeros solo sirvió de plantilla en el sistema polimerasa de ADN; sin embargo, una mezcla de los dos, que forma una hélice sintética de doble tira con emparejamiento Watson y Crick ordinario de las bases, puede servir de plantilla.

    La plantilla de ADN tiene dos funciones en el sistema de polimerasa de ADN; La primera proporciona grupos 3`- H libres para servir de extremo en el crecimiento del polímero de ADN. La segunda plantilla de ADN proporciona información codificada. Se requiere una molécula de doble tira porque cada tira del par sirve de plantilla para la extensión. El polímero semejante a ADN que es producido por la acción de la polimerasa del ADN en presencia de una plantilla de tira doble es también de tira doble. Tiene la misma composición básica que la plantilla de ADN. Las razones de las bases en el producto son las predichas por el modelo Watson y Crick.

    Ácidos nucleicos

    La síntesis de ADN se produce en las células de organismos superiores sólo durante la interfase cuando los cromosomas están en su forma extendida y no son fácilmente visibles. Así, si un sistema enzimático similar a la polimerasa del ADN, de Kornberg, cataliza la síntesis de ADN in vivo, debe haber cierta clase de señal biológica que iniciará la síntesis del ADN en este momento y la terminará en otro. Parece que la enzima, la polimerasa del ADN y los substratos dATP, dGTP, dCTP, y dTTP están presentes en todo momento. La explicación más plausible en la actualidad es que cierta clase de cambio en la plantilla de ADN inicia la síntesis de ADN en el momento apropiado del ciclo celular, y luego la termina.

    Ácidos nucleicos

    DUPLICACIÓN SEMICONSERVADORA.

    Durante la duplicación del ADN, se forman dos nuevas tiras, cada una de las cuales es complementaria de las tiras de ADN existentes en la espiral de doble tira. La espiral de doble tira se desenrolla; una tira proporciona una plantilla para una nueva tira, y la otra tira original proporciona una plantilla para la segunda nueva tira. Esto se conoce como duplicación o replicación semiconservadora: donde las dos tiras originales de ADN son retenidas o conservadas en el producto, una en cada una de las dos espirales hijas.

    Ácidos nucleicos

    Importantes datos experimentales confirman la idea de que cada cromosoma eucariótico es una sola molécula de ADN. Las moléculas de ADN de la mosca de la fruta Drosophila, está comprobado que tienen 2.1 cm. de longitud, precisamente la longitud del cromosoma más largo.

    Para que una célula eucariótica pueda duplicar una molécula tan enorme durante el tiempo que toma un ciclo celular, la duplicación no empieza simplemente en un extremo de la molécula y prosigue hasta el otro. Por el contrario, empieza a diversos niveles a todo lo largo del cromosoma y prosigue en ambas direcciones desde el origen con ritmo aproximadamente igual, de un micrómetro por minuto.

    En el experimento clásico de Meselson y Stahl se usó nitrógeno pesado, para distinguir moléculas "viejas" y "nuevas" de ADN y proporcionar pruebas de que la duplicación del ADN se efectúa realmente por un proceso semiconservador, por lo menos en las bacterias. Bacterias cultivadas durante varias generaciones en un medio que contenía nitrógeno pesado tenían ADN que fue titulado con 15N. Cuando se aisló una muestra de ADN y se centrifugó en un tubo que contenía un gradiente de densidad de cloruro de cesio, el ADN se recogió en un nivel del tubo que refleja su mayor densidad, debido a la presencia de átomos de nitrógeno pesado.

    Las bacterias fueron transferidas entonces del medio 15N a un medio que contenía nitrógeno ordinario, 14N, y se dejó que se dividiera una vez más en este medio. Cuando se aisló y centrifugó el ADN procedente de esta generación de bacterias, todo el ADN fue más ligero, con una densidad esperada si tenía la mitad de átomos de 15N que el ADN de la generación progenitora. SI la teoría de Watson y Crick es correcta y la duplicación es semiconservadora, podría esperarse este resultado, porque una tira del ADN de doble tira en cada organismo sería rotulada con 15N y la otra sólo contendría 14N.

    Cuando se dejó dividir estas bacterias una segunda vez en el medio 14N, cada molécula de ADN de la progenie recibió una vez más una tira progenitora y una nueva tira que sólo contenía 14N, y apareció como ADN ligero en la centrifugación. Las tiras progenitoras que contienen 15N produjeron tiras complementarias que contienen 14N, que se sedimentaron por centrifugación con una densidad característica del estado de espiral doble mitad 15N, mitad 14N. Así, las tiras progenitoras originales de ADN no se dispersan o dividen durante el proceso de duplicación, sino que se conservan y pasan a la siguiente generación de células. Cada tira de la espiral doble progenitora es conservada en una célula hija diferente, por lo que el proceso se denomina semiconservador.

    Si la duplicación de las tiras comienza al iniciarse el desenrollamiento de las tiras, serán evidentes moléculas de ADN en forma de Y durante el proceso de duplicación. Esas regiones en forma de Y han sido halladas por autorradiografía de cromosomas de Escherichia coli titulados con 3 H- timidina.

    Como resumen podemos mencionar que la duplicación o replicación del ADN es un proceso semiconservativo, es decir cada doble hélice contiene una cadena antigua y otra recién sintetizada. En el modelo de Watson y Crick se reconoce que las dos cadenas de ADN están enrolladas una en la otra, como los hilos de una cuerda ADN helicasas que recorren la hélice desenrollando las cadenas a medida que avanzan. Luego proteínas desestabilizantes de la hélice que impiden que se forme la doble hélice mientras se copian las cadenas. Las topoisomerasas mantienen la estabilidad necesaria para cada copia.

    La enzima encargada de copiar los moldes de ADN o hebras es la ADN polimerasa que agrega los nucleótidos sólo en el extremo 3`. La enzima es la encargada de unir los nucleótidos en forma complementaria y la cadena nueva siempre crece en el sentido 5` a 3`.

    Ácidos nucleicos

    La ADN polimerasa sólo agrega nucleótidos al extremo 3`de una cadena polinucleótida ya existente. Entonces al principio se fábrica un segmento pequeño de ARN, llamado ARN cebador o ARN primer y permite el inicio de la duplicación. Luego de esto la ADN polimerasa agrega nucleótidos al extremo 3`de ARN cebador. Posteriormente este ARN es degradado y su espacio ocupado por ADN.

    La duplicación de ADN comienza en sitios específicos denominados orígenes de duplicación y ambas cadenas se duplican al mismo tiempo en una estructura con forma de Y que se conoce como horquilla de duplicación. Una de las hebras del ADN, la 3´ a 5`, se copia con facilidad en el sentido 5` a 3`, es la cadena continua. La otra cadena es discontinua porque se va sintetizando en fragmentos cortos, que se denominan:

    Fragmentos de Okasaki: Cada fragmento de Okasaki es iniciado por un ARN cebador. Cuando un fragmento en crecimiento llega a otro ya sintetizado, una parte de la ADN polimerasa es degradada al ARN cebador previo permitiendo que la ADN ligasa una los extremos de un fragmento y otro.

    La mayor parte de la síntesis de ADN es bidireccional. Una vez que se abre el ADN se forman dos horquillas de replicación.

    Ácidos nucleicos

    6) CÓDICO GENÉTICO

    Desde que se demostró, que las proteínas eran producto de los genes, y que cada gen estaba formado por fracciones de cadenas de ADN, los científicos llegaron a la conclusión de que, debe haber un código genético, mediante el cual, el orden de las cuatro bases nitrogenadas en el ADN, podría determinar la secuencia de aminoácidos en la formación de polipéptidos. En otras palabras, debe haber un proceso mediante el cual las bases nitrogenadas transmitan la información que dicta la síntesis de proteínas. Este proceso podría explicar cómo los genes controlan las formas y funciones de las células, tejidos y organismos. Como en el ADN sólo hay cuatro tipos de nucleótidos, y, sin embargo, las proteínas se constituyen con 20 clases diferentes de aminoácidos, el código genético no podría basarse en que un nucleótido especificara un aminoácido. Las combinaciones de dos nucleótidos sólo podrían especificar 16 aminoácidos (42 = 16), de manera que el código debe estar formado por combinaciones de tres o más nucleótidos sucesivos. El orden de los tripletes, o como se han denominado, codones, podría definir el orden de los aminoácidos en el polipéptido. Diez años después de que Watson y Crick determinaran la estructura del ADN, el código genético fue descifrado y verificado. Su solución dependió en gran medida de las investigaciones llevadas a cabo sobre otro grupo de ácidos nucleicos, los ácidos ribonucleicos (ARN). Se observó que la obtención de un polipéptido a partir del ADN se producía de forma indirecta a través de una molécula intermedia conocida como ARN mensajero (ARNm). Parte del ADN se desenrolla de su empaquetamiento cromosómico, y las dos cadenas se separan en una porción de su longitud. Una de ellas actúa como plantilla sobre la que se forma el ARNm (con la ayuda de una enzima denominada ARN polimerasa).

    Universalidad del código genético
    Tres décadas han pasado ya desde que fue descifrado el código genético, y muchas son las proteínas, RNAM y DNA que se han estudiado. Las pruebas son ahora abrumadoras: el código genético es universal para prácticamente todos los seres vivos, desde la Escherichia coli al Homosapiens. UUA, por ejemplo, codifica para el aminoácido leucina, no sólo en los procariotas, sino también en protistas, hongos, plantas y animales. El 1 código genético, desde sus orígenes se ha mantenido constante y es la prueba fehaciente de la unidad de todos los seres vivos.
    Sin embargo, se han hallado algunas excepciones en el código genético .La mayoría de ellas se refieren a las mitocondrias, las cuales contienen su propio DNA, transcriben sus propios RNA y conducen la síntesis de algunas proteínas. En algunos casos, el código mitocondrial es distinto de los cromosomas de procariotas y eucariotas.

    Ácidos nucleicos

    El código genético tiene una serie de características:

    - Es universal, pues lo utilizan casi todos los seres vivos conocidos. Solo existen algunas excepciones en unos pocos tripletes en bacterias.

    - No es ambigüo, pues cada triplete tiene su propio significado

    - Todos los tripletes tienen sentido, bien codifican un aminoácido o bien indican terminación de lectura.

    - Está degenerado, pues hay varios tripletes para un mismo aminoácido, es decir hay codones sinónimos.

    - Carece de solapamiento, es decir los tripletes no comparten bases nitrogenadas.

    • Es unidireccional, pues los tripletes se leen en el sentido 5´-3´.

    SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

    La traducción del ARNm

    El ARN mensajero es el que lleva la información para la síntesis de proteinas , es decir, determina el orden en que se unirán los aminoácidos.

    La síntesis o traducción tiene lugar en los ribosomas del citoplasma celular. Los aminoácidos son transportados por el ARN de transferencia (ARNt) , específico para cada uno de ellos, y son llevados hasta el ARN mensajero (ARNm), dónde se aparean el codón de éste y el anticodón del ARN de transferencia, por complementariedad de bases, y de ésta forma se situa en la posición que les corresponde.

    Una vez finalizada la síntesis de una proteína, el ARN mensajero queda libre y puede ser leído de nuevo. De hecho, es muy frecuente que antes de que finalice una proteína ya está comenzando otra, con lo cual, una misma molécula de ARN mensajero, está siendo utilizada por varios ribosomas simultáneamente.

    Los ARNt desempeñan un papel central en la síntesis de las proteínas :La síntesis proteica tiene lugar en el ribosoma, que se arma en el citosol a partir de dos subunidades riborrucleoproteicas provenientes del nucléolo. En el ribosoma el ARN mensajero (ARNm) se traduce en una proteína, para lo cual se requiere también la intervención de los ARN de transferencia (ARNt). El trabajo de los ARNt consiste en tomar del citosol a los aminoácidos y conducirlos al ribosoma en el orden marcado por los nucleótidos del ARNm, que son los moldes del sistema

    La síntesis de las proteínas comienza con la unión entre sí de dos aminoácidos y continúa por el agregado de nuevos aminoácidos de a uno por vez en uno extremos de la cadena.

    Como se sabe la clave de la traducción reside en el código genético, compuesto por combinaciones de tres nucleótidos consecutivos o tripletes en el ARNm. Los distintos tripletes se relacionan específicamente con tipos de aminoácidos usados en la síntesis de las proteínas.Cada triplete constituye un codón: existen en total 64 codones, 61 de los cuales sirven para cifrar aminoácidos y 3 para marcar el cese de la traducción. Tal cantidad deriva de una relación matemática simple: los cuatro nucleótidos (A, U, C y G)se combinan de a tres , por lo que pueden generarse 64 (43).Dado que existen más codones, (61) que tipos de aminoácidos (20), casi todos pueden ser reconocidos por más de un codón, por lo que algunos tripletes a como "sinónimos". Solamente el triptófano y la metionina dos de los aminoácidos menos frecuentes en las proteínas son codificados, cada uno, por un solo codón.

    Fig. A-1. Los dibujos ilustran cuatro de los seis codones que codifican al aminoácido leucina (Leu). Los dos de la izquierda se aparean con un mismo anticodón, igual que el par de codones de la derecha. Ello es posible porque la tercera base de los codones suele ser “adaptable ”, es decir, puede establecer uniones con una base no complementaria.

    Los aminoácidos se ligan por medio de uniones peptídicas: La unión de los aminoácidos entre sí para construir una proteína se produce de modo que el grupo carboxilo de un aminoácido se combina con el grupo a amínoácido siguiente, con pérdida de una molécula de agua H2O y recordemos que esa combinación se llama unión peptídica.

    Cualquiera que sea su longitud, la proteína mantiene el carácter anfotérico de los aminoácidos aislados, ya que contiene un grupo amino libre en uno de sus extremos y un grupo carboxilo en el otro extremo. La proteína se sintetiza a partir de extremo que lleva el grupo amino libre. Ello se corresponde con la dirección 5´ 3´ usada para la traducción del ARNm, la misma con que el ADN se transcribe .

    Los ARNm arribados al citoplasma se conectan con ríbosomas :Los transcriptos primarios de los ARNm se hallan combinados con diversas proteínas, con las que forman las nueleoproteínas heterogéneas nucleares o RNPhn.. Los ARNm salen hacia el citoplasma por los poros de la envoltura nuclear. Ya en el citosol, cada ARNm se combina con nuevas proteínas y con ribosomas, lo que lo habilita para ejercer su función codificadora durante la síntesis proteica. Entre las proteínas se encuentra la llamada CBP, que se combina con el cap en el extremo 5´ del ARNm. Su papel será analizado más adelante.Algunos ARNm se localizan en sitios prefijados en el citoplasma, de modo que las proteínas que codifican se sintetizan y se concentran en esos sitios.

    Las moléculas de los ARNt adquieren una forma característica : Así la función básica de los ARNt es alinear a los aminoácidos siguiendo el orden de los codones para poder cumplir con sus funciones, los ARNt ,adquieren una forma característica semejante a un trébol de cuatro hojas .Los cuatro brazos se generan por la presencia en los ARNt de secuencias de 3 a 5 pares de nuelcótidos complemen tarios, los cuales se aparean entre sí como los nucleótidos de las dos cadenas del ADN.

    En la punta de uno de los brazos confluyen los extremos 5' y 3´ del ARNt. El extremo 3´ es más largo, de modo que sobresale el trinucleótido CCA que fue incorporado durante el procesamiento. Este brazo se llama aceptador porque a él se liga el aminoácido, que se une a la A del CCA.Los tres brazos restantes poseen en sus extremos secuencias de 7 a 8 nucleótidos no apareados, con forma de asas, cuyas denominaciones derivan de los nucleótidos que las caracterizan.

    Las etapas de la síntesis de proteínas:

    1) La etapa de iniciación es regulada por proteínas citosólicas denominadas factores de iníciación (IF), que provocan dos hechos separados pero concurrentes , uno en el extremo 5´del ARNm y otro en la subunidad menor del ribosoma

    El primer proceso involucra al cap y a una secuencia de nucleótidos aledaña, localizada entre el cap y el codón de iniciación . Estas partes reconocidas por el factor IF-4, que se liga a ellas sí al ARNm se proteína CBP . La conexión del IF-4 con el ARNm insume energía que es provista por un ATP.En el segundo proceso, el metioníl-ARNt[i]met se coloca en el sitio P de la subunidad menor del ribosoma, reacción que requiere el factor IF-2 y la energía de un GTP. Logrados ambos acondicionamientos, otro factor de iniciación, el IF-3, con la ayuda del IF-4 coloca el extremo 5´ del ARNm sobre una de las caras de la unidad menor del ribosoma, la que posee los sitios P y A. De inmediato la subunidad menor se desliza por el ARNm y detecta al codón de AUG de iniciación, que se coloca, en el sitio P . Como es lógico , el segundo codón del ARNm queda colocado al lado, es decir en el sitio A. Entre tanto, el metioril-ARNt[i]met ,' ubicado en el sitio P de la subunidad menor, se une al codón AUG de iniciación mediante su anticodón CAU (UAC ). El acoplamiento correcto entre estos dos tripletes es imprescindible para asegurar el encuadre normal de los siguientes codones del ARNm en los sitios P y A del ribosoma. La etapa de iniciación concluye cuando la subunidad menor se combina con la subunidad mayor y se forma el ribosoma. En él se encuentran los primeros dos codones del ARNm: en el sitio P el codón AUG de iniciación -unido al metionilARNt[i]met- y en el sitio A el codón que le sigue.

    La unión entre sí de las dos subunidades ribosómicas se produce luego del desprendimiento del IF-2 y del IF-3, lo cual es mediado por el factor IF-5.

    2) La etapa de alargamiento comienza cuando al sitio A del ribosoma se acerca otro aminoacil-ARNtAA, compatible con el segundo codón del ARNm, con el cual se une. La reacción es mediada por un factor de elongación llamado EF-1 y consume energía, que es aportada por un GTP.Al quedar el aminoacil-ARNtAA cerca del metionil-ARN[t]met. la metionina localizada en el sitio P, al tiempo que se desacopla del. ARNt[i], se liga - mediante una unión peptidica - al aminoácido ubicado en el sitio A. Se forma así un dipeptidil-ARNt, que continúa ubicado en el sitio A. Su permanencia en este sitio es breve.

    La unión peptídica es catalizada por la subunidad mayor del ribosoma. Debe agregarse que la energía requerida para consumar esa unión proviene de la ruptura de otra unión química , aquella que liga al aminoácido con la adenina en el brazo aceptador del ARNt. Como en el caso del metionil - ARNt [i]met, la ruptura química tiene lugar siempre en el sitio P.

    Entre tanto, fuera del ribosoma, esperando para ingresar, se encuentra el tercer codón del ARNm. Aborda el ribosoma cuando el ARNm se corre tres nucleótidos en dirección de su extremo 5´. Este proceso llamado traslocación es mediado por el el factor de elongación EF-2 y también consume energía ahora aportada por un GTP. Como vemos, desde el punto de vista energetico la sintesis proteica es bastante costosa, ya que por cada aminoácido que se incorpora se consume dos GTP y un ATP, el último gastado durante 1a síntesis del aminoacil-ARNtAA. El corrimiento del ARNm hace que el codón de iniciación sea desalojado del sitio P sitio P y, por consiguiente, del ribosoma el segundo codón se mude del sitio A al sitio P y el tercer codón ingrese en el sitio A vacante. Lógicamente el corrimiento de los codones desplaza también a los ARNt , por lo que el ARNt[i] sale del ribosoma -no tarda en desprenderse del codón de iniciación y el dipéptido pasa del sitio A al sitio P. Mientras tanto, un tercer aminoacil-ARNtAA ingresa en le ribosoma , se acomoda en el sitio A y su anticodón se une al tercer codón de ARNm, otra vez por la intervención del EF-1. Debe señalarse que el EF-1 actúa después que el EF-2 se retira del ribosoma, y viceversa. El paso siguiente comprende la formación de una unión peptídica entre el dipéptido y el aminoácido del tercer aminoacil -ARNt AA. Esta unión peptídica, ahora entre e dipéptido y el aminoácido del tercer aminoacil-ARNtAA. Esta unión peptídica genera un tripeptidil AARNt, que permanece en el sitio P hasta la próxima translocación del ARNm.

    Los procesos citados se repiten de forma sucesiva codón tras codón ; así , en el cuarto paso se forma un tetrapeptidil ARNt y luego peptidil - ARNt cada vez más largos , que se traslocan del sitio A al P conforme se producen las uniones peptídicas. Se calcula que se agregan a la cadena, en promedio, cinco aminoácidos por segundo.Debido a que con cada traslocación se corren tres nucleótidos del ARNm , su extremo 5´se aleja progresivamente del ribosoma y su extremo 3´se acerca a él en igual medida. Cuando el ribosoma se ha alejado del extremo 5´del ARNm unos 90 nucleótidos, en el codón de iniciación se acomoda un nuevo ribosoma, lo cual da inicio a la síntesis de otra cadena proteica. Esto se repite varias veces

    3) La etapa de terminación determina la conclusión de la síntesis de la proteína cuando el sitio A del ribosoma es abordado por el codón de terminación del ARNm (UUA, UGA o UAG, indistintamente). Ello deja al sitio A sin el esperado aminoacil-ARNtAA, aunque pronto es ocupado por un factor de terminación llamado eRF (eucaryotic releasing factor), que sabe reconocer a los tres codones de terminación. En síntesis la terminación de la cadena polipeptídica está señalada por el ARNm mediante un codón que no especifica la incorporación de ningún aminoácido. Ese codón de terminación puede ser UUA, UGA o UAG, y sobre él no se une ningún ARNt. En cambio, es reconocido por dos proteínas llamadas factores de liberación (eRF). Cuando esto sucede, la proteína terminada se libera del último ARNt, que también se separa del ARNm. Por último también se disocian las subunidades ribosómicas.

    Ácidos nucleicos

    7) ANOMALÍAS GENÉTICAS

    Son producidas como consecuencia de anomalías hereditarias de la estructura genética. También se pueden dar por influencias ambientales.

    Son más conocidas como enfermedades cromosómicas, se expresan por alteraciones fenotípicas múltiples y graves. La mayoría de las alteraciones en el número de cromosomas son letales, se expresan como abortos. Generalmente cuanto más grande es el cromosoma alterado o la masa de cromatina involucrada, más graves son los efectos en el fenotipo del individuo. Por eso las pocas alteraciones cromosómicas viables se encuentran en cromosomas pequeños.

    Podemos clasificarlas en dos tipos:

    1) Alteraciones en el número de cromosomas

    Estas alteraciones pueden ser del conjunto de cromosomas completo o de un cromosoma en particular.

    a) Alteraciones numéricas en estructuras completo:

    Poliploidía: variación en el número de la serie haploide de cromosomas (23 en humanos)

    -Triploidía: con dotación 69 XXY, 69 XXX, 69 XYY...

    -Tetraploidía: con dotación XXXX, XXYY...

    b) Alteraciones numéricas en estructuras parciales.

    -Aneuploidía: les falta o tienen exceso de cromosomas, pero pequeño, puesto que si les falta o les sobra en exceso en gran cantidad, no sería viable.

    Este fenómeno es debido a la no disyunción meiótica ocurrida en la primera o segunda división meiótica.

    Existen aneuploidías autosómicas y sexuales:

    Aneuploidías autosómicas:

    Trisomía 21 o Síndrome de Down :

    La trisomía 21 es la cromosomopatía más frecuente y la primera causa de retraso mental. Las alteraciones morfológicas del síndrome de Down o trisomía 21 son muy características, siendo fácil el diagnóstico clínico. Estas alteraciones incluyen hipotonía, braquicefalia, hipertelorismo, epicanto, presencia de manchas de Brushfield, protrusión lingual, paladar ojival, entre otras. Otras complicaciones que presentan son atresia duodenal, epilepsia, mayor susceptibilidad a infecciones y leucemia. El retraso mental es la complicación más importante del síndrome. Los pacientes tienen un coeficiente intelectual inferior a 50. El 95% de los casos de síndrome de Down tienen una trisomía 21 regular con cariotipo 47, +21. Alrededor del 1% de los pacientes con síndrome de Down son mosaicos, con la coexistencia de una línea normal de 46 cromosomas y una línea trisómica de 47, +21. El 4% de los casos de síndrome de Down tienen una alteración no equilibrada cuyo origen es una translocación robertsoniana ya sea parental o de novo. Estas translocaciones afectan principalmente los cromosomas 14, 22 y 21, que se fusionan con el cromosoma 21. La edad materna superior a 35 años y la existencia de antecedentes familiares y/o de cromosomopatía son indicaciones de diagnóstico prenatal. El 95% de los casos de síndrome de Down se deben a ausencia de disyunción cromosómica durante la meiosis. Los marcadores polimórficos del DNA han permitido determinar en qué progenitor se ha producido la alteración y en qué etapa de la meiosis ha sucedido. El 80% de los casos se deben a una no disyunción durante la primera división meiótica y el 75% es de origen materno, guardando relación con la mayor edad de la madre. La existencia de casos raros con trisomías muy parciales ha permitido localizar la región q22.2-q22.3 como la responsable directa de las alteraciones presentes en el síndrome de Down.

    Trisomía 18 o Síndrome de Edwards :

    La incidencia de esta alteración es de uno de cada 8.000 nacimientos, con un exceso en el sexo femenino respecto al masculino (4:1). La incidencia real es probablemente mucho mayor, ya que el 95% de los fetos afectos son abortados de forma espontánea. El 90% de los afectados mueren durante el primer año. Las malformaciones características del síndrome incluyen retraso de crecimiento, frente ancha, occipucio prominente, micrognatia, esternón corto y pelvis estrecha, entre otros. El aspecto de las manos es muy característico con los dedos siempre en la misma posición. Los pacientes presentan malformaciones renales, cardíacas y de otros órganos. El retraso mental es muy profundo. La mayoría de los casos se deben a una trisomía regular por no disyunción durante la primera o la segunda división meiótica, mientras que el 10% de los casos corresponden a mosaicismos.

    Trisomía 13 o Síndrome de Patau :

    La incidencia se calcula entre uno de cada 4.000 a 10.000 recién nacidos. Sólo el 10% sobrevive al año de vida. La mayoría de los pacientes padecen ceguera, sordera y crisis epilépticas, presentando la totalidad retraso mental muy profundo. Algunas de las principales características son microcefalia, microftalmía, orejas malformadas, paladar y labio hendidos y polidactilia. Las malformaciones congénitas afectan el cerebro, los riñones y el corazón. El 75% de los casos se deben a no disyunción meiótica y, por lo tanto, muestran una trisomía regular con la consiguiente influencia de la edad materna; el 20% se debe a la presencia de una translocación robertsoniana, fundamentalmente t(13q14q) en uno de los padres, y el resto es causado por translocaciones de novo. En alrededor del 5% de los casos existe mosaicismo.

    Monosomías: pérdida de un cromosoma.

    Aneuploidías sexuales:

    Síndrome de Klinefelter, XXY :

    El síndrome de Klinefelter puede definirse como varones con hipogonadismo que poseen como mínimo dos cromosomas X y uno Y. La incidencia es de uno de cada 1.000 varones recién nacidos. Es la causa más frecuente de hipogonadismo y esterilidad en varones (10%). En general son de elevada estatura, presentan hipoplasia testicular y producen concentraciones bajas de testosterona, con lo que el desarrollo de los rasgos sexuales secundarios es escaso, apareciendo ginecomastia en el 40% de los casos. El coeficiente intelectual es algo inferior al normal. El cariotipo es 47,XXY, siendo raras las anomalías estructurales, y en el 10% de los casos se detectan mosaicismos. Se describen también polisomías X (48,XXXY o 49,XXXXY) que pueden formar parte de mosaicos con líneas normales de 46,XY o 47,XXY. El cromosoma X extra es de origen materno en el 60% de los casos y se produce por ausencia de disyunción en la división meiótica.

    Síndrome de Turner, XO :

    Turner describió un síndrome en mujeres de talla baja (130-150 cm), con disgenesia gonadal, Pterygium colli y Cubitus valgus. Manifestaciones clínicas frecuentes son amenorrea primaria, linfedema en las recién nacidas, coartación aórtica y acortamiento del cuarto metacarpiano. El desarrollo intelectual es normal en la mayoría de las pacientes. Las manifestaciones clínicas son variables debido a que el síndrome engloba alteraciones distintas en el cariotipo, siendo la más típica (40-60% de los casos) la monosomía del cromosoma X (45,X). Otras alteraciones incluyen: 46,X,i(Xq) isocromosoma de brazos largos, que supone una monosomía para los cortos y una trisomía para los largos; 46,X,del Xp, deleción de brazos cortos; 46,X,del Xq, deleción de brazos largos, y otras alteraciones estructurales del cromosoma X, como un cromosoma X en anillo 46,X,r(X), 46,X,i(Xp) isocromosoma de brazos cortos, translocaciones del cromosoma X a un autosoma e inversiones. Los mosaicismos son también frecuentes.

    2) Alteraciones estructurales :

    Las alteraciones estructurales son muy variadas y sus efectos son más complejos. Afectan a varios cromosomas. A continuación se muestran algunas de las causas de estas alteraciones

    -Delecciones:

    Las roturas cromosómicas pueden producir la pérdida de parte de un cromosoma. Si la parte que se pierde es grande, la situación es incompatible con la vida. La mayoría de las deleciones ocurren de novo y alrededor del 15% se deben a un reordenamiento equilibrado en uno de los padres, con lo que estas deleciones representan una monosomía o trisomía parciales; las deleciones verdaderas constituyen el 85% de los casos. Algunos de los fenotipos se asocian a una región cromosómica específica; uno de los más típicos es el síndrome del maullido de gato, que se asocia a una deleción en el cromosoma 5: del(5)(p15pter).

    -Duplicaciones: repetición de un segmento del cromosoma.

    -Translocaciones:

    Las translocaciones recíprocas son bastante frecuentes, calculándose que uno de cada 1.000 individuos es portador de una translocación equilibrada recíproca, la cual puede dar lugar, en la meiosis, a gametos duplicados o delecionados, a gametos normales y a gametos equilibrados, iguales a los originales. Un tipo particular de translocaciones lo constituyen las robertsonianas, cuya relación con los síndromes de Down y de Patau les confiere una mayor relevancia clínica. El origen de las translocaciones está en la fusión céntrica de dos cromosomas acrocéntricos, de forma que quedan los dos brazos largos unidos entre sí, mientras que los dos cortos se pierden sin aparente repercusión clínica.

    -Inversiones: cambio de orden del segmento de un cromosoma.

    -Cambios robertsonianos:

    Fisión: fragmentación del cromosoma.

    Fusión: unión de dos cromosomas acrocéntricos en uno solo.

    -Lugares cromosómicos frágiles:

    Síndrome del cromosoma X frágil

    El síndrome del cromosoma X frágil se transmite como un trastorno mendeliano de tipo dominante ligado al cromosoma X, con una penetrancia incompleta (80% para varones y 30% para mujeres) y una expresividad variable. El grado de afectación clínica es muy variable, siendo la tríada más característica el retraso mental, la facies dismórfica y el macrorquidismo en varones. El nombre del síndrome se debe a que los individuos afectos muestran una fragilidad citogenética en el cromosoma X, en la banda Xq27.3, cuando se exponen las células a condiciones de cultivo pobres en ácido fólico. Dicho punto frágil se denomina FRAXA (retraso mental ligado al cromosoma X frágil tipo A). La alteración molecular responsable del síndrome del cromosoma X frágil, afecta a un gen, al que se ha denominado FMR-1.

    8)

    1- ¿Cuáles son, a tu juicio, los puntos fuertes y débiles de cada una de la hipótesis planteadas?

    Una de las hipótesis plantea al DNA como molécula precursora de todo organismo vivo, esto se puede fundamentar en el hecho de que en esta macromolécula es donde se almacena el código genético y es la que determina la síntesis de las enzimas proteicas necesarias para el metabolismo y consecuentemente, para la vida. Sin embargo, no se pudo establecer qué habría surgido primero , las proteínas o los ácidos nucleicos, ya que la existencia del DNA es primordial pero las proteínas son las que mediante las enzimas mantienen las reacciones metabólicas claves para la materia viva. Es así como surgió la teoría del RNA ya que este posee la capacidad de replicarse y ejecutar las instrucciones, o sea este hubiera contado con capacidad de replicarse sin ayuda de proteínas y capacidad de catalizar cada etapa de la síntesis proteica, facultades de las que hoy carece, habría podido existir un mundo de ARN donde éste catalizara todas las reacciones necesarias para la supervivencia y reproducción , contaba con la capacidad de unir aminoácidos y formar proteínas. También se hablo de que el ARN podía autorreplicarse sin la ayuda de proteínas, es decir, se autofragmentaba en dos y posteriormente se volvía a unir, actuando de gen y catalizador al mismo tiempo. De esta manera una molécula pequeña de RNA habría dirigido la síntesis de los primeros péptidos y supuestamente estos péptidos ayudarían que este proceso de autorreplicación se realizara de manera más eficiente. Es así como más tarde el RNA sufrió modificaciones que le permitió dirigir la síntesis de una molécula de ácidos nucleico más activa y estable, dio origen al ADN, molécula que en la actualidad es la principal depositaria de la información hereditaria. Esta hipótesis es totalmente factible bajo las bases planteadas pero en esta teoría la falla es la incógnita del origen del ARN,¿Cómo se originó el primer ARN?. Pues bien, acerca de este tema existen varias teorías pero problema persiste ya que no se han podido comprobar experimentalmente, por lo tanto no se pueden dar como ciertas.

    Esto se debe fundamentalmente a que la macromolécula ARN pese a que fue recibida con mucha alegría por los evolucionistas prebióticos porque daba esperanza de disminuir la necesidad de fabricar proteínas en la primera célula. La misma fue llamada "ribozima" y probó ser incapaz de responder a la situación debido a dos factores: ella esta muy limitada porque no es capaz de producir los precursores de ARN por cualquier mecanismo prebiótico considerado hasta ahora .

    La ribozima pretende resolver:

    1) Mientras que una ribosa puede ser producida bajo las condiciones pre-bioticas simuladas a través de la reacción de formosa, esta es un azucar raro en los polímeros de formaldeído (mecanismo pre-biotico que se acredita dar origen a los azucares). A demás de la prersencia de sustancias de nitrogeno dichos aminoácidos en la mezcla de reacción podrian prevenir la sintesis de azucares (Shapiro, 1988).

    2) Cuando una ribosa es producida y condensada con una base nucleotica, tenemos una mexcla de isomeros ópticos, y por lo tanto solo uno es relevante a los estudios pre-bioticos.

    3) La polimerización de los nucleotidos es inhibida por la incorporación de tal enantiomorfo.

    4) Mientras que solo los polimeros 3'-5' ocurren en los sistemas biologicos, polimeros 5'-5' y 2'-5' son favorecidos en las reacciones sinteticas de tipo prebiológico (Joyce and Orgel, 1993).

    5) Ninguna de las 5 bases presentes en DNA/RNA son producidas durante la oligomerización HCN en soluciones diluidas (el mecanismo pre-biotico que se cree que dió origen a las bases nucleotídicas). Muchas otras bases no codificadoras competirian durante la polimerización en mayores concentraciones de HCN.

    Además de los problemas de síntesis de los precursores y de las reacciones de polimerización, todo el bosquejo depende en la habilidad para sintetizar una molécula de RNA la cual es capaz de hacer una copia de si misma, una hazaña que hasta ahora ha eludido esfuerzos extremados. La molécula debe también realizar alguna función vital para iniciar la fuerza de la vida. Hasta ahora toda esta conversación de un " Mundo de RNA" permanece en nuestros deseos mejor categorizada como ficción. El punto más desbastador de este esquema es que no ofrece pistas de como llegar desde este bosquejo del mecanismo de las proteínas de ADN-ARN de todas las células vivas. El hecho de que algunos científicos deciden exhibir tal entusiasmo por este esquema, revela que poca fe tienen en los otros escenarios del origen de la vida.

    2- ¿ Qué relaciones puedes establecer entre el mecanismo de reproducción del virus del sida, cuyo material genético es ácido ribonucleico y la hipótesis del RNA?

    Primeramente debemos indicar que todos los genomas de retrovirus, de 10 Kb aproximadamente, consisten en dos moléculas de RNA, las cuales son de cadena simple y sentido positivo. Además poseen un cap en 5' y una cola de poly-A en 3'. Los retrovirus tienen cuatro propiedades:

    -Son los únicos virus realmente diploides.
    -Son los únicos virus RNA cuyo genoma es producido por la maquinaria transcripcional de la célula.
    -Son los únicos virus cuyo genoma requiere un tRNA para la replicación.
    -Son los únicos RNA de sentido (+) cuyo genoma no funciona como mRNA directamente después de la infección.
    Ácidos nucleicos
    El RNA es la parte del VIH que puede hacer que se produzca más virus.

    Los Retrovirus

    El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) es un "Retrovirus". Los retrovirus son una familia de virus ARN (familia retroviridae), capaces de integrarse ("unirse") en el genoma de la célula (ADN de la célula) que infectan. Esta integración la realizan en forma de ADN, y desde el genoma de la célula infectada dirigen su replicación (multiplicación).

    Si los retrovirus contienen ARN y se integran como ADN, antes de la integración (unión) tendrán que convertir el ARN en ADN. De hecho, la propiedad fundamental de su replicación es la transcripción inversa, es decir, la formación de ADN a partir de ARN; de ahí la denominación de retrovirus (retrotranscripción).

    Este fenómeno se produce en el citoplasma celular por acción de la enzima viral transcriptasa inversa o retrotranscriptasa. Cuando el ARN viral se ha convertido en un ADN ya se encuentra en condiciones de penetrar en el núcleo celular y de integrarse en su genoma.

    Cuando un retrovirus infecta a una célula huésped, el ARN retroviral se convierte en ADN por acción de la transcriptasa inversa. El ADN retroviral (provirus) se integra en el genoma de la célula infectada y desde esta posición, y a través de diversos ARN mensajeros codificados por los diferentes genes, va a dirigir la síntesis de nuevos elementos virales. Estos elementos se ensamblan ("se unen") y abandonan la célula huésped adquiriendo de la misma parte de la envoltura, generando un nuevo virion.

    Por las características dadas de la definición del VIH podemos concluir con respecto del ARN que en ambos tienen una ordenación codificada las cuales le da su ordenamiento de activación, ambas se integran a las células como ADN , la transcripción es por medio de un enzimas. Son monocatenario al igual que el ARN . El VIH y el ARN se integra en el genoma celular lo hace de por vida y permanecerá integrado mientras la célula esté viva.

    Concluimos que el VIH es capaz de revertir el sentido de flujo normal de información genética, es decir, la que va de la molécula de ADN a la de ARN, como ocurre en la síntesis de proteínas común. El material genético de los retrovirus no es el ADN, si no que es el ARN, a partir del cual es capaz de sintetizar moléculas de ADN, mediante la acción de una enzima que contiene el virus, llamada retrotranscriptasa. El ADN vírico sintetizado es capaz de incorporarse en el ADN de la células que infecta y desde allí dirigir las operaciones para producir nuevos virus.

    Análisis de la hipótesis ARN y VIH:

    Hipótesis ARN

    VIH

    Intermediario de la información genética del ADN y como enzima.

    También transmite su información genética al ADN.

    Tuvo capacidades de autoduplicarse.

    Es capaz de autoduplicarse

    Rápido proceso de autoduplicación

    Rápido proceso de autoduplicación.

    Permanece en la célula hasta su muerte

    Permanece en la célula hasta su muerte

    3- ¿ Por qué no resulta sencilla la investigación científica que permite evaluar la hipótesis del RNA?

    La investigación científica no resulta sencilla por el hecho de que para comprobar esta hipótesis se requiere crear un ambiente idéntico al que generaría la macromolécula de RNA.

    Hay que tomar en cuenta que todos los intentos experimentales de formar las cadenas tanto del ADN como del ARN, en condiciones supuestamente similares a la Tierra primitiva, han fracasado. El "mundo pre-ARN" del que se viene hablando en los últimos años, y que explicaría en definitiva el comienzo de una actividad propiamente biológica, no pasa de ser más que un mundo complejo y enigmático, entramado a base de suposiciones y conjeturas de muy difícil solución.

    4- ¿ Qué beneficios tiene para la sociedad conocer la macromolécula responsable para el origen de la vida?

    La cantidad de teorías existentes demuestran que el misterio del origen de la vida sobre la Tierra, aun en el presente, con todos los adelantos en la ciencia, sigue siendo tan difícil de entender como lo fue para los primeros hombres que se cuestionaron sobre el tema. Sin embargo, las investigaciones continúan y el hombre no se dará por vencido hasta que resuelva el problema.

    La aspiración de explicar de modo coherente el problema del origen de la vida es no sólo un reto apasionante, sino también una aventura en sí misma legítima. Pero querer hacerlo partiendo sólo de planteamientos científicos, es, hoy por hoy -y lo ha sido a lo largo de la historia reciente-, una de las mayores utopías que puede pretender el hombre moderno.

    El origen de la vida sigue siendo, después de todo, un misterio rodeado, eso sí, de un buen número de fantásticos escenarios virtuales. Es cierto, a la vez, que las investigaciones realizadas hasta la fecha han inducido importantes avances en numerosos campos de investigación. En este sentido, cabe esperar que la búsqueda de los orígenes de la vida contribuya a conocerla mejor.

    Su generalidad como molécula es múltiple, pero también es una amenaza para la sociedad.

    El tratar de investigarla cada vez más nos ha traído muchos problemas ,como también muchas beneficios. El conocerla nos da la posibilidad de imaginar como fue la combinación de nuestros progenitores, cual fue el que mas domino, que gen recesivo participo, etc. hay tantas preguntas envase a esta macromolécula que es muy interesante conocerla. La sociedad tiene una gran confianza en esta macromolécula , ya que se cree que al intervenirla o al cambiar su estructuración puede ser la solución de las enfermedades hereditarias.

    CONCLUSIÓN

    La información que los progenitores transmiten a sus descendientes se halla en los grandes ácidos nucleicos, los cuales son los depósitos de información genética.

    El ADN se localiza fundamentalmente en el núcleo (cromosomas), pero también se le encuentra en pequeñas cantidades en mitocondrias y cloroplastos. Y en células procariontes dispersa en el citoplasma por carencia de núcleo.

    Los ácidos nucleicos están formados por una pentosa, ácido fosfórico y bases púricas (adenina y guanina) y pirimídicas (timina , citosina y uracilo).

    En general, la información del ácido desoxirribonucleico (ADN) se transcribe en los ácidos ribonucleicos (ARN), y éstos participan en la traducción en proteínas, es decir, de la siguiente manera:

    ADN ARN PROTEÍNAS

    De tal manera que el ADN contiene el “original” de la información hereditaria, y el ARN es una especie de copia de la información que existe en el ADN. Por lo tanto, encontramos ARN formando parte de la estructura de los organelos celulares que fabrican proteínas, los cuales son los ribosomas.

    Las anomalías genéticas hereditarias producen las llamadas enfermedades cromosómicas, las cuales son alteraciones del código genético, algunas veces, se deben a condiciones ambientales nocivas, como por ejemplo habitar en zonas agrícolas, las cuales se encuentran constantemente expuestas a pesticidas nocivos para la salud.

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    Biología General Elena Curtis

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